Le système racinaire est pivotant mais avec de nombreuses racines adventives, partant de la région du collet. La fixation de l'azote atmosphérique se fait grâce à la symbiose avec Rhizobium leguminosarum var. trifolii.

Les tiges sont plus ou moins dressées, ramifiées de 3 à 5 entre-noeuds qui proviennent du développement des bourgeons à l'aisselle des feuilles. La plante peut atteindre 80 cm.

Les feuilles sont trifoliées, à folioles oblongues entières ou à peine denticulées dans la partie supérieure, le pétiole est d'autant plus long que les feuilles sont situées plus bas sur la tige. Les feuilles se différencient de celles de la luzerne par des folioles plus larges présentant une bande blanchâtre à leur base.

Les fleurs de Trifolium pratense sont regroupées en capitules globuleux de 80 à 140 fleurons. La fleur est typique des papilionacées. On compte 5 sépales soudés à la base. La corolle, constituée de 5 pétales partiellement soudés, persiste et s'accroît après la floraison en devenant membraneuse. La colonne sexuelle composée du style et de 10 étamines (9 soudées et une libre) est enfermée dans la carène.

Le trèfle est allogame, à pollinisation entomophile (par les abeilles et les bourdons) et à forte incompatibilité pollinique gamétophile. L'auto-incompatibilité du trèfle violet est connue depuis Darwin.
Les seuls insectes capables d'ouvrir les fleurs de trèfle violet et d'effectuer la pollinisation, sont comme dans le cas de la luzerne, des apoïdes. L'insecte pollinisateur déclenche la fleur en faisant basculer cette colonne sexuelle hors de la carène. La longueur des corolles et la longueur de la langue des apoïdes sont des facteurs déterminants de la pollinisation.

La gousse ovoïde ne renferme généralement qu'une seule graine. Cette dernière, en forme de haricot, mesure de 1,5 à 5 mm de long. Elle est dépourvue de glumelles, et possède peu de réserves.
Elle présente une couleur violette plus ou moins bigarrée de jaune olive. Le poids de 1 000 graines est de 1,7 à 2 g pour les variétés diploïdes, 2,5 à 3 g pour les tétraploïdes. Certaines graines sont dites "dures" c'est-à-dire qu'elles présentent des téguments imperméables à l'eau. Le nombre de graines de trèfle violet dans un gramme est pour une variété diploïde de 500 à 600 graines, pour une variété tétraploïde de 400 à 500 graines.