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Caractérisation moléculaire des transformants
Caractérisation moléculaire des transformants
Utilisation de la PCR
Les marqueurs RFLP
Les marqueurs RFLP
Couple enzyme / sonde

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Visualisation d'un fragment d'ADN


Visualisation d'un fragment d'ADN
Visualisation d'un fragment d'ADN
L'électrophorèse révèle les fragments d'ADN
Visualisation d'un fragment d'ADN

Les enzymes de restriction

Chaque enzyme de restriction reconnaît une séquence d'ADN qui lui est spécifique, le site de restriction. Elle coupe alors les deux brins de la molécule d'ADN.
 
Les fragments d'ADN obtenus sont appelés fragments de restriction.
Ils sont plus facilement utilisables et identifiables qu'une molécule d'ADN entière. Ces enzymes sont utilisées comme des ciseaux biologiques pour réaliser des constructions d'ADN recombiné, ainsi que pour l'analyse de l'ADN, notamment de sa variabilité. Elles sont d'utilisation simple.


L'électrophorèse

L'action d'une enzyme de restriction génère des fragments de restriction de tailles différentes. Ces fragments peuvent être séparés suivant leur taille sur un gel d'électrophorèse. Pour cela, on dépose l'ADN dans des encoches appelées puits, situées à l'extrémité du gel. Celui-ci est ensuite soumis à un champ électrique. Les molécules d'ADN migrent car elles sont chargées négativement. En passant à travers les mailles du gel, elles se séparent suivant leur taille. Ainsi, les molécules les plus grandes sont retardées par rapport aux petites.
 
La visualisation des fragments d'ADN après électrophorèse se fait par trempage du gel dans une solution de bromure d'éthidium. Cette molécule s'intercale entre les bases de l'ADN et a la propriété d'être fluorescente sous lumière ultraviolette.
 
Dans le cas d'ADN génomique, on génère une population de fragments, tandis que dans le cas d'ADN mitochondrial ou chloroplastique, on n'observe que quelques fragments de taille déterminée.
Après la migration, la taille des fragments est estimée par comparaison des distances de migration avec celles de fragments de tailles connues qui servent d'étalon.
 
Par comparaison des profils obtenus dans chaque puits, correspondant chacun à un individu, on peut mettre en évidence des différences entre les individus, c'est-à-dire visualiser le polymorphisme de leur ADN.


L'hybridation moléculaire

L'hybridation moléculaire permet de repérer ou de rechercher un fragment d'ADN dans un mélange de fragments. Cette méthode d'étude repose sur deux propriétés de la molécule d'ADN :
 
- L'ADN a la faculté de passer de façon réversible de l'état double brin à l'état simple brin, c'est la dénaturation des brins d'ADN ou inversement la renaturation. Sous l'action de la température et/ou d'agents chimiques, il y a rupture des liaisons entre les bases et séparation des brins. L'abaissement de la température provoque la renaturation des brins, on parle d'hybridation.
 
- Cet appariement ne se fait pas au hasard, il suit la loi de complémentarité entre les bases de l'ADN. C'est la deuxième propriété des molécules d'ADN : il y a formation uniquement de paires A-T et G-C.
 
L'objectif de l'hybridation est de révéler si une molécule d'ADN contient une séquence ou un gène particulier. Pour ce faire, on utilise une sonde. C'est un fragment d'ADN correspondant à une séquence connue. La sonde est en général marquée soit radioactivement, soit chimiquement. En utilisant le phénomène de renaturation et d'appariement des bases d'ADN, il est possible de repérer la molécule comportant la séquence complémentaire.


Description de la technique d'hybridation

Les molécules cibles d'ADN à caractériser sont au préalable rendues simple brin et fixées sur une membrane d'hybridation en nylon. La sonde simple brin marquée et la molécule cible sont mises en contact dans des conditions permettant la renaturation. Lorsque la sonde reconnaît son homologue, il y a hybridation. Un lavage permet d'éliminer l'excédent de sonde. Ainsi, seuls les hybrides ADN sonde - ADN cible restent marqués. S'il s'agit d'un marquage radioactif, le contact avec un film radioactif permettra de repérer les cas d'hybridation.

Dans le cas de la technique de Southern, la sonde est un fragment d'ADN.

On peut également utiliser un fragment d'ARN.


Les sondes

 La sonde marquée radioactivement est fabriquée par accrochage in vitro de 32P (isotope radioactif du phosphore) sur les nucléotides.
 
On peut également fabriquer des sondes non radioactives dites froides, qui utilisent des nucléotides marqués à l'aide de groupements chimiques spécifiques.