Ressources pédagogiques de la filière semences
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Au cœur de l’ADN

LA VISUALISATION D'UN FRAGMENT D'ADN

Les enzymes de restriction

Chaque enzyme de restriction (découvertes chez les bactéries) reconnaît une séquence d’ADN qui lui est spécifique, le site de restriction. Elle coupe les deux brins de la molécule d’ADN à cet endroit.
Les fragments d’ADN obtenus sont appelés fragments de restriction. Ils sont plus facilement utilisables et identifiables qu’une molécule d’ADN entière. Ces enzymes sont utilisées comme des ciseaux bio­logiques pour réaliser des constructions d’ADN recombiné, ainsi que pour l’analyse de l’ADN, notamment de sa variabilité. Ces enzymes de restriction sont d’uti­lisation simple.

Les enzymes de restriction constituent le moyen de défense des bactéries contre les virus. Chaque bactérie a son enzyme de restriction, par exemple EcoR1 pour Escherichia coli.

L’électrophorèse

L’action d’une enzyme de restriction sur l’ADN génomique préalablement isolé génère des fragments de restric­tion de tailles différentes. Ces fragments peuvent être séparés suivant leur taille sur un gel d’électrophorèse. Pour cela, on dépose l’ADN dans des encoches appelées puits, situées à l’extrémité du gel. Celui­-ci est ensuite soumis à un champ électrique. Les molécules d’ADN migrent car elles sont chargées négativement. En passant à travers les mailles du gel, elles se séparent suivant leur taille. Ainsi, les molécules les plus grandes sont retardées par rapport aux petites.
La visualisation des fragments d’ADN après électrophorèse se fait à l’aide de bromure d’éthidium par exemple. Cette molécule s’intercale entre les bases de l’ADN et a la propriété d’être fluorescente sous lumière ultraviolette.
Dans le cas d’ADN génomique, on génère une population de frag­ments, tandis que dans le cas d’ADN mitochondrial ou chloroplastique, on n’observe que quelques fragments de taille déterminée.
Après la migration, la taille des fragments est estimée par comparaison des distances de migration avec celles de fragments de tailles connues qui servent d’étalon.
Par comparaison des profils obtenus dans chaque puits, correspondant chacun à un individu, on peut mettre en évidence des différences entre les individus, c’est à dire visualiser le polymorphisme de leur ADN, essentiellement après hybridation.

L’hybridation moléculaire

L’hybridation moléculaire permet de repérer ou de rechercher un fragment d’ADN dans un mélange de fragments. Cette méthode d’étude repose sur deux propriétés de la molécule d’ADN :

  • L’ADN a la faculté de passer de façon réversible de l’état double brin à l’état simple brin, c’est la dénaturation des brins d’ADN ou inversement la renaturation. Sous l’action de la température (95°C) et/ou d’agents chimiques, il y a rupture des liaisons entre les bases et séparation des brins. L’abaissement de la température provoque la renaturation des brins, on parle d’hybridation.
  • Cet appariement ne se fait pas au hasard, il suit la loi de complémentarité entre les bases de l’ADN. C’est la deuxième propriété des molécules d’ADN : il y a formation uniquement de paires A-T et G-C.

L’objectif de l’hybridation est de révéler si une molécule d’ADN contient une séquence ou un gène particulier (valable également pour l’ARN). Pour ce faire, on utilise une sonde qui est un fragment d’ADN correspondant à une séquence connue. La sonde est en général marquée chimiquement (production de lumière le plus souvent). En utilisant le phénomène de renaturation et d’appariement des bases, il est possible de repérer le fragment d’ADN comportant la séquence complémentaire.

Description de la technique d’hybridation

Les molécules cibles d’ADN à caractériser sont au préalable rendues simple brin et fixées sur une membrane d’hybridation en Nylon. La sonde simple brin marquée et la molécule cible sont mises en contact dans des conditions permettant la renaturation. Lorsque la sonde reconnaît son homologue, il y a hybridation. Un lavage permet d’éliminer l’excédent de sonde. Ainsi, seuls les hybrides (spécifiques) ADN sonde – ADN cible restent marqués. S’il s’agit, le plus souvent, d’un marquage chimique produisant des photons, le contact avec un film permettra de repérer les hybridations.

Dans le cas de la technique Southern, la sonde est un fragment d’ADN et l’hybridation sera de type ADN/ADN. Pour repérer des ARN particuliers. Il s’agit alors de la technique Northern pour qualifier une hybridation de type ADN/ARN.

Les sondes

Actuellement, on fabrique principalement des sondes dites froides, qui utilisent des nucléotides marqués à l’aide de réactions chimiques complexes productrices de photons.

L'AMPLIFICATION DE FRAGMENTS D'ADN

La PCR, réaction de polymérisation en chaîne (Polymerase Chain Reaction), est une technique permettant d’obtenir, à partir d’un échan­tillon d’ADN, d’importantes quantités d’une séquence d’ADN spéci­fique. Cette amplification repose sur la réplication d’une matrice d’ADN double brin. Elle se décompose en trois phases : une phase de dénaturation de l’ADN, une phase d’hybridation et une phase d’élongation. Les produits de chaque étape de synthèse servent de matrice pour les étapes suivantes, ainsi une amplification exponentielle de la séquence recherchée est réalisée et sera alors facilement visualisée.

Applications

La PCR permet de multiplier de l’ADN en grande quantité, elle ouvre ainsi la voie à de très nombreuses applications :

  • Le diagnostic. Par exemple, lorsque l’on transforme génétiquement des végétaux, il est important de déterminer si l’ADN transféré est intégré dans le patrimoine génétique de la cellule. La PCR permet de réaliser ce diagnostic rapide de présence éventuelle de l’ADN transféré, sur de faibles quantités d’ADN.
  • Le marquage. La PCR par elle-­même ne révèle pas de polymorphisme, mais elle aboutit à la création de nouveaux types de marqueurs, qui révèlent un polymorphisme de fragment d’amplification. Ce sont des marqueurs simples d’utilisation et souvent très polymorphes.

Le clonage et le séquençage de gènes sont également simplifiés par cette technique.

La dénaturation

C’est la séparation des deux brins d’ADN à 95 degrés.

L’hybridation

Les amorces spécifiques s’hybrident sur les molécules « simple brin d’ADN » à une température donnée qui dépend de la séquence de l’amorce. Les amorces sont constituées de courtes séquences d’ADN complémentaires de la séquence de l’ADN à amplifier. Il s’agit toujours d’un couple d’amorces complémentaires encadrant le fragment d’ADN à amplifier.

L’élongation

C’est la synthèse du brin complémentaire. Une enzyme ADN polymérase, la Taq polymérase (issue de la bactérie Thermus aquaticus) ajoute à l’extrémité de l’amorce des nucléotides présents dans le milieu de réaction, suivant la séquence de l’ADN à copier (matrice).
Un thermocycleur, sorte de bain-marie, où les montées et descentes en température sont programmées et très rapides, permet de réaliser un grand nombre de cycles.