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Les étapes de la transgénèse
Les étapes de la transgénèse
La création d'une nouvelle variété OGM se fait en 4 étapes
Réalisation de la construction génétique
Réalisation de la construction génétique
Il faut avant tout identifier le gène d'intérêt

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L’obtention d’une variété OGM


Schéma d'obtention d'une variété OGM
Schéma d'obtention d'une variété OGM
Il faut évaluer la plante créée avant de la croiser avec une variété commerciale
Schéma d'obtention d'une variété OGM
Lors de la transformation génétique, une, deux ou plusieurs copies du gène peuvent s'insérer à différents endroits sur les chromosomes. Ainsi, chaque cellule transformée pourra donner une plante différente. Ce sont autant d'événements de transformation.


Caractérisation moléculaire et biochimique des transformants



Il faut d'abord s'assurer qu'une plante sélectionnée par sa résistance à un agent de sélection, herbicide ou antibiotique, a bien intégré le gène d'intérêt dans son génome. Ensuite, l'événement de transformation doit être caractérisé. On identifie le ou les sites d'intégration du gène et le nombre de copies intégrées dans le génome. Ces paramètres peuvent influencer le niveau d'expression du gène. Ainsi des analyses moléculaires sont conduites afin d'analyser les événements de transformation.
 
Enfin, il faut s'assurer que le gène introduit s'exprime et produit la protéine désirée, en quantité suffisante. Pour cela, des analyses biochimiques vont être réalisées. A cette étape, de nombreuses plantes transgéniques seront éliminées par défaut d'expression du gène d'intérêt.


La caractérisation moléculaire des transformants

Caractérisation moléculaire des transformants
Caractérisation moléculaire des transformants
Utilisation de la PCR
Caractérisation moléculaire des transformants

Lorsque l'on transforme génétiquement une plante, il est important de déterminer rapidement si l'ADN transféré est intégré dans le patrimoine génétique de la plante. En effet, la sélection des cellules sur un milieu contenant l'agent de sélection n'est pas suffisamment fiable. Certaines cellules, bien que non transformées, parviennent quand même à se développer sur le milieu de sélection.
 

Un premier diagnostic : la PCR


La PCR (Polymerase Chain Reaction), réaction de polymérisation en chaîne, permet sur d'infimes quantités d'ADN de détecter l'éventuelle présence du transgène.

A l'aide d'amorces spécifiques, cette technique permet de déterminer si une plante porte le gène transféré ou non, et permet également de suivre la transmission du nouveau gène dans la descendance. Les fragments amplifiés sont visualisés par migration sur un gel et leur taille est comparée à celle du fragment attendu. Ainsi sur la photographie, on observe que seules les plantes B et D possèdent un fragment pouvant correspondre au gène d'intérêt transféré.

Pour caractériser si ce gène s'exprime, on utilisera la PCR reverse (RT-PCR). Cette technique permet de vérifier la présence d'ARN messager, transcrit spécifiquement à partir du gène introduit.
 

Une analyse plus fine : la technique de Southern
 

Une analyse plus fine pourra ensuite être réalisée par hybridation moléculaire ADN-ADN, selon la technique de Southern. Seule l'hybridation spécifique permet de démontrer que le gène transféré est intégré dans le génome. L'ADN total de la plante est digéré séparément par différentes enzymes de restriction. Les fragments d'ADN ainsi obtenus sont séparés par électrophorèse. Ils sont ensuite transférés par capillarité sur une membrane en nylon. Enfin, une hybridation à l'aide d'une sonde marquée (correspondant à tout ou une partie du gène transféré) permettra de déterminer le nombre de copies du transgène intégrées au génome de la plante. Ainsi dans le cas des plantes B et D, B possède une seule copie et D trois copies.


La caractérisation biochimique des transformants

Caractérisation biochimique des transformants
Caractérisation biochimique des transformants
Vérification de l'activité de la protéine
tags : transgénèse | OGM | gène | protéine |
Caractérisation biochimique des transformants
Après vérification de la présence du nouveau gène dans la plante, il est nécessaire de déterminer si ce gène produit ou non la protéine désirée et en quelle quantité. Pour tester la présence et l'activité de la protéine, un test Elisa (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay, Immuno-essais avec couplage enzymatique) est utilisé.

Pour cela, les protéines sont obtenues à partir du broyage de tissus de plantes transformées. Ce test repose sur une liaison spécifique entre un anticorps anti-protéine cible fixé à la paroi des puits d'une plaque Elisa et la protéine produite par le gène. Un deuxième anticorps spécifique de la protéine, couplé à une enzyme, est ajouté dans le milieu. Si la protéine est présente, il se forme un complexe anticorps-protéine-anticorps. Ensuite, on réalise un test colorimétrique : le substrat de l'enzyme est ajouté au milieu, il se lie sur les complexes fixés à la paroi et la solution change de couleur.

C'est donc une méthode visuelle de détection de la présence de la protéine.

Un lecteur de plaque Elisa permet de mesurer l'activité de la protéine, sur la base de différences d'intensité de couleur.

Sur la photographie représentant la plaque Elisa, certains puits ont changé de couleur. Dans les puits restés clairs, les plantes n'ont pas produit de protéine, elles seront donc éliminées, tandis que dans les puits dont la couleur a changé, il y a eu production de la protéine désirée. C'est une méthode simple de révélation.


Evaluation de la valeur agronomique de la plante

Des analyses portent également sur le comportement général de la plante. Il s'agit de savoir si le gène introduit confère le caractère souhaité, et de valider l'efficacité du caractère. D'autre part, l'activité du gène étranger peut interférer avec le métabolisme général de la plante. Il faut donc vérifier que le potentiel de la plante n'est pas atteint. Ainsi, des tests en serre et en champ sont menés.
Il est notamment très important de vérifier que le comportement au champ de plantes transgéniques correspond à celui attendu sur la base des observations effectuées en serre sur une ou quelques plantes. A ce stade, le niveau et la stabilité de l'expression du caractère dans différentes conditions de culture sont évalués. Seules quelques plantes seront retenues.
 
Enfin, il faut caractériser la transmission du caractère à la descendance.


Introgression dans une lignée commerciale élite

La plante ayant intégré le gène d'intérêt et satisfaisant le mieux à l'évaluation agronomique est retenue, on parle de lignée mère. Toutefois, cette plante n'est généralement pas encore la variété commerciale. En effet, l'efficacité de transformation et de régénération étant dépendante du génotype, la plante qui a été transformée est d'un génotype facilitant ces étapes. Le gène est ensuite transféré dans une lignée commerciale élite par rétrocroisements. Au cours de ces générations d'hybridation, on ne conserve que le gène d'intérêt et on élimine le reste du patrimoine génétique de la lignée mère.
Le résultat de ce processus est l'obtention d'une lignée quasiment identique à la lignée élite, mais contenant le nouveau caractère transgénique. La variété transgénique obtenue est alors proposée à l'inscription.
 
L'obtention d'une variété OGM est le résultat de nombreuses années d'analyses et d'expérimentations.