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Les principaux marqueurs moléculaires
Les principaux marqueurs moléculaires
Caractéristiques des principaux marqueurs
L'empreinte génétique d'une plante
L'empreinte génétique d'une plante
Les marqueurs permettent d'établir une empreinte génétique d'une plante

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Les Marqueurs RFLP



La technique RFLP :

La technique RFLP
La technique RFLP
Polymorphisme de longueur de fragment de restriction
La technique RFLP
Polymorphisme de longueur de fragment de restriction
(Restriction Fragment Length Polymorphism)
 
Toute modification des séquences d'ADN (mutation, addition, délétion) réorganise fréquemment les sites de restriction. Lors de l'action d'enzymes de restriction, la taille des fragments de restriction est alors modifiée : on observe un polymorphisme.
 
 

Les étapes de la technique

1. L'ADN de la plante est extrait.
 
2. Il est soumis à une digestion par une ou plusieurs enzymes de restriction. La taille des fragments obtenus est dépendante des enzymes utilisées.
 
3. Les fragments sont ensuite séparés selon leur taille par électrophorèse. Lors de la digestion de l'ADN génomique, on visualise sur le gel une traînée appelée « smear », car il y a un grand nombre de fragments impossibles à séparer.
 
4. L'ADN est transféré par capillarité sous forme dénaturée (simple brin) sur une membrane de nylon. Cette technique de transfert permet de conserver la position relative des fragments d'ADN.
 
5. Cette membrane est mise en contact avec une solution contenant une sonde marquée soit par la radioactivité, soit chimiquement. Cette sonde s'hybride alors avec le ou les fragments d'ADN avec lesquels elle présente une homologie.
 
6. La position de l'hybridation est révélée en plaçant la membrane au contact d'un film sensible, ou en réalisant une réaction enzymatique colorée (selon le type de sonde utilisé).
 
Ces trois dernières étapes de transfert, d'hybridation et de révélation correspondent à la technique de Southern.


Les marqueurs RFLP

Les marqueurs RFLP
Les marqueurs RFLP
Couple enzyme / sonde
Les marqueurs RFLP

Caractéristiques du polymorphisme

Comparons deux individus A et B. Leur ADN sera digéré séparément par des enzymes de restriction données (triangle et losange), puis hybridé par une sonde S.
 
La digestion avec l'enzyme –losange- donne des fragments de restriction identiques pour les deux individus. Les deux profils révélés après électrophorèse ne permettent pas de les distinguer. Avec ce couple enzyme - sonde S, aucun polymorphisme n'est mis en évidence.
 
En revanche, pour l'enzyme –triangle-, l'individu B présente une mutation au niveau d'un site de restriction, entraînant la perte de ce site. Ainsi, par digestion, l'individu A donne un fragment plus petit que celui de l'individu B. On révèle le polymorphisme entre les deux individus : un fragment rapide pour A et un plus lent pour B.
 
Ce couple enzyme  - sonde S révèle un polymorphisme.
  

Création de marqueurs

C'est le couple enzyme/sonde qui constitue le marqueur. La sonde révèle un locus polymorphe ou monomorphe.
 
Les enzymes de restriction permettent de visualiser le nombre d'allèles détectables à ce locus dans une population. Chez le maïs, 95 % des sondes utilisées sont polymorphes, alors que chez le blé, plante autogame, 5 à 10 % des sondes seulement sont polymorphes.

Utilisation des marqueurs moléculaires

Cette technique de marquage moléculaire est très utilisée, car elle fournit des profils peu complexes permettant de caractériser l'empreinte génétique d'une plante ou de construire une carte génétique. Elle est fiable, les résultats observés peuvent être répétés. Toutefois, elle est lourde à mettre en oeuvre : l'étape de transfert et d'hybridation empêche une automatisation du travail.