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Réalisation de la construction génétique
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Il faut avant tout identifier le gène d'intérêt
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La cartographie d’un gène majeur



Localiser les gènes majeurs

Cartographie d'un gène majeur
Cartographie d'un gène majeur
Exemple du tournesol
Cartographie d'un gène majeur
Quand un caractère est dû à l'effet d'un gène principal, on parle de gène majeur. L'apparition des marqueurs moléculaires a permis l'élaboration de méthodologies pour localiser ces gènes. Le principe est le même que celui servant à l'élaboration des cartes génétiques. Plus la distance qui sépare un marqueur moléculaire et un gène d'intérêt sur la carte génétique est faible, plus la probabilité qu'ils soient transmis séparément à la descendance est infime.


Exemples

De nombreux gènes majeurs ont déjà été localisés. On peut citer par exemple : des gènes de qualité codants pour une protéine de réserve du blé, codants pour le taux en acide érucique chez des oléagineux, des gènes de nanisme chez le maïs ou le colza, des gènes de résistance aux champignons chez la tomate, la laitue, le blé, le tournesol, dont le gène Pl1 impliqué dans la résistance à la race 1 du mildiou, des gènes de résistance aux virus chez la pomme de terre, l'orge, des gènes de résistance aux nématodes chez la betterave, des gènes de restauration de la stérilité mâle cytoplasmique chez le colza et le tournesol.


Détection de la liaison

Elle consiste à choisir des parents suffisamment polymorphes pour le caractère agronomique et à observer dans la descendance la ségrégation des caractères phénotypiques et du génotype des marqueurs moléculaires.
 
Une des populations qui peut être retenue pour l'analyse de la ségrégation pour un gène majeur est une descendance F2 issue de deux parents homozygotes.
 
Dans le cas d'un gène de résistance, il s'agit du croisement d'un parent sensible et d'un parent résistant. Ainsi en F2, on observe un quart d'individus sensibles et trois quarts de résistants. L'idée qui a été émise par Michelmore et al. en 1991 est de regrouper l'ADN des individus F2 sensibles et l'ADN des individus F2 résistants. Cette technique est appelée BSA, Bulk Segregant Analysis, c'est l'analyse de ségrégation en mélange.
 
Le génotype du marqueur est ensuite déterminé. Si le marqueur testé est lié au gène de résistance, les plantes sensibles portent l'allèle marqueur caractéristique des plantes sensibles. En revanche, les individus résistants sont soit homozygotes pour le gène de résistance, soit hétérozygotes, il en va donc de même pour leur génotype du marqueur. Ainsi, en mélange, les individus résistants présentent au moins l'allèle marqueur caractéristique des plantes résistantes.


Apport à la sélection

La mise en évidence d'une liaison entre un marqueur moléculaire et un gène majeur est une aide précieuse pour le sélectionneur. Comme un fragment de feuille suffit à obtenir l'ADN nécessaire pour établir l'empreinte génétique d'une plante, un tri précoce et précis peut être envisagé dès le début de la croissance des plantes. Ceci permet un gain de temps, il n'est pas nécessaire d'attendre la visualisation phénotypique du gène.
 
On peut ainsi cribler une collection de géniteurs et déterminer si par exemple des plantes possèdent une source de résistance.
 
D'autre part, par le biais de marqueurs moléculaires, il est possible d'identifier les plantes hétérozygotes, donc porteuses d'un gène récessif dont le phénotype n'est pas observable.


Analyse fine de la structure du gène

L'objectif final est le clonage du gène et l'analyse de son mode d'action. Ceci fait appel à des techniques de biologie moléculaire, appelées clonage positionnel. Cette caractérisation fine de la structure du gène permet également de faciliter une sélection précoce. L'isolement de ce gène rend aussi possible son transfert par génie génétique vers d'autres espèces.


Le clonage positionnel

Le clonage positionnel d'un gène consiste à isoler le gène à partir des marqueurs qui lui sont liés. Pour cela, il est nécessaire de disposer de marqueurs du gène à la distance physique la plus faible possible du gène.
 
Les différents fragments d'ADN obtenus sont insérés dans des plasmides. On obtient des colonies de bactéries, ou clones, ayant recombiné dans leurs plasmides des fragments d'ADN se chevauchant partiellement.
 
Par leur criblage, on espère "atterrir" directement sur les clones contenant le gène.